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Nato a Roma nel 1637 da una nobile famiglia fiorentina, compì i propri studi a Pisa sotto la guida di Malpighi, Borelli e Viviani. Letterato e divulgatore scientifico, fu uomo di Corte al servizio dei Medici. Per decisione del Principe Leopoldo, nel 1660 venne nominato segretario dell'Accademia del Cimento, fondata nel 1657, e mantenne tale carica fino al suo scioglimento nel 1667. Nello stesso anno curò la stampa dei Saggi di naturali esperienze, in cui venivano descritti gli esperimenti scientifici compiuti dagli accademici e gli strumenti da loro impiegati.
Negli anni successivi Magalotti compì una serie di viaggi che lo portarono in tutta Europa, prima al servizio del Granduca Ferdinando II, poi come accompagnatore del futuro Granduca Cosimo III, infine con incarichi diplomatici ufficiali. Raccolse queste esperienze nelle Relazioni varie, che mostravano la sua indubbia capacità nel ritrarre un personaggio, una Corte o una società nei loro tratti più curiosi, e il suo interesse per i problemi politici, economici, scientifici.
Nel 1662 Magalotti aveva aderito all'Accademia della Crusca. La conoscenza di varie lingue straniere, oltre che di quelle classiche, lo indusse a promuovere una lingua più sciolta, aperta al neologismo, lessicalmente e sintatticamente più ricca di sfumature. In questi anni si dedicò anche alla traduzione parziale del Paradise Lost di Milton e al commento dei primi cinque canti dell'Inferno dantesco. Più tardi, seguendo lo stile dei saggisti inglesi, scrisse le Lettere scientifiche ed erudite, pubblicate postume nel 1721, il Canzoniere, La donna immaginaria, le Canzonette anacreontiche, firmate con il nome arcadico di Lindoro Elateo, ed alcune novelle ad imitazione del Boccaccio. Importante fu inoltre la sua attività di traduttore dallo spagnolo, dall'inglese, dall'arabo e dal greco.
Quando nel 1678 Cosimo III lo rimosse improvvisamente dall'incarico di ambasciatore a Vienna, Magalotti si ritirò nella villa di Lonchio, presso Firenze, dove sarebbe morto nel 1712. Risalgono a questi anni le Lettere familiari sopra l'ateismo, pubblicate postume nel 1719. In linea con la tradizione di Galileo, Magalotti rivendicava la separazione tra scienza e teologia per conciliare l'indagine scientifica, e in particolar modo la spiegazione atomistica della natura, con i principii della religione cristiana. Non esitava a professarsi "ateo" in campo filosofico, nel senso che riconosceva i limiti di tutti i sistemi nella spiegazione dei principi primi dell'universo e non ne accettava pertanto nessuno. Dichiarava di essere atomista, ma solo perché questa filosofia spiegava in maniera più comprensibile alcuni effetti naturali. Scriveva nell'ottava delle Lettere familiari: "Io internamente non sono più democritico che platonico o peripatetico o stoico, o di qualunque altra setta di antichi o di moderni filosofi
. Io son ateo di tutte: solamente per esser di qualche partito, mi dirò, se volete, democritico, perché questa in oggi par la filosofia più alla moda pe' secolari".
L'isolamento di Magalotti si concluse nel 1691 quando, dopo essersi ritirato presso l'Oratorio dei Filippini a Roma, tornò alla vita pubblica. Scrisse in quel periodo la sua opera più importante, le Lettere su le terre odorose d'Europa e d'America dette volgarmente buccheri del 1695. Si trattava di una relazione sui "buccheri", cioè su quelle argille odorose con cui si fabbricavano vasi non smaltati che contenevano l'acqua fresca. Magalotti utilizzò una prosa sensuale e raffinata attingendo alle forme e alle ricercatezze arcadico-barocche per descrivere il modo in cui questi odori venivano percepiti dai sensi.
Per molti aspetti del carattere e della personalità Magalotti e Redi si assomigliavano, e questo certamente favorì la loro fraterna amicizia. Entrambi amavano le facezie e gli scherzi e si dilettavano di poesia, anche se si piccavano di rivendicare la rispettiva superiorità. Ecco come Redi motivava, di fronte alle critiche dell'amico, le proprie scelte linguistiche: "Il suo pensiero parmi più poetico del mio, ma la mia cuoca, colla quale comunico sempre i mei sonetti, mi approva più i miei versi che i suoi, perché i miei gl'intende, e per quegli di V. S. Illustrissima questa povera donna ha avuto bisogno d'un po' di comento". Per altri aspetti i due amici erano invece molto diversi. Basti pensare che Magalotti fu un grande viaggiatore e diplomatico, che visitò quasi tutti i paesi d'Europa. Redi invece, a parte qualche viaggio in gioventù, una volta entrato a Corte non uscì mai più fuori del Granducato. Non a caso definiva l'amico "l'Ulisse della Toscana".
Magalotti partecipò, insieme a Redi Borelli Oliva Rinaldini e Viviani, alle ricerche e alle discussioni degli accademici del Cimento sul controverso tema della generazione degli insetti delle galle. A lui Redi indirizzò il suo primo saggio di carattere scientifico, le Osservazioni intorno alle vipere del 1664  . Da parte sua, l'ex-segretario del Cimento fu l'ispiratore del famoso Ditirambo Bacco in Toscana  , grazie al brindisi pronunciato in occasione dello "stravizzo" della Crusca del 12 settembre 1666, nel corso del quale aveva sostenuto che non era l'amore ma il vino a reggere il mondo.
Magalotti, che era piuttosto grassoccio, si divertiva ad apostrofare il suo allampanato "Redino" con epiteti del tipo "mummia d'Egitto", oppure lo definiva "un aretino che pare il ritratto della fame". Redi, da parte sua, replicava di voler baciare quanto prima, appena l'amico sarebbe rientrato in patria, "quei bei gotoni giovialocci innaffiati di cervogia, concimati e rimpinzati di burro".
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